In Berlin geboren, verbrachte der österreichische Dirigent seine Kindheit und Jugend in Graz. Schon früh künstlerisch ambitioniert, zieht er schließlich das Cellostudium dem Marionettentheater vor, das ihn über Jahre intensiv beschäftigt hatte. Nach der Ausbildung an der Wiener Musikakademie wird er 1952 Cellist bei den Wiener Symphonikern. Ein Jahr später gründet er gemeinsam mit seiner Frau Alice den Concentus Musicus Wien, um seiner immer intensiveren Arbeit mit Originalinstrumenten und der musikalischen Aufführungspraxis von Renaissance- und Barockmusik ein Forum zu geben. Nikolaus Harnoncourt sammelt historische Instrumente - allerdings ausschließlich, um sie zum Musizieren einzusetzen - und entwickelt parallel zum Musizieren und Dirigieren auch in musikphilosophischen Schriften, die im Salzburger Unterricht entstanden, seine Analysen der "Musik als Klangrede", bis heute die Standardwerke der historischen Aufführungspraxis, die Eröffnung eines ganzen Kosmos von vergessenen Werken und verschütteten Klangerfahrungen.

Von 1972 an unterrichtete Nikolaus Harnoncourt Aufführungspraxis und historische Instrumentenkunde als Professor am Salzburger Mozarteum. Parallel dazu wächst sein Erfolg als Operndirigent. Nach seinem Debüt am Theater an der Wien mit Monteverdis "Il ritorno d´Ulisse in patria" 1971 folgte der inzwischen legendäre Zyklus von Monteverdis Musiktheaterwerken, zusammen erarbeitet mit dem Regisseur Jean-Pierre Ponnelle am Opernhaus Zürich, ein weltweit als sensationell betrachteter Durchbruch. Dem schloss sich, ebenso exemplarisch und richtungsweisend, am selben Haus und mit Ponnelle als Partner ein Zyklus von Mozart-Opern an.
Sowohl im symphonischen Repertoire als auch im Musiktheater führte Nikolaus Harnoncourts Weg als Dirigent über die Wiener Klassik zum romantischen Repertoire und ins 20. Jahrhundert. Einige Stationen auf diesem Weg: die Wiener Staatsoper mit einem Mozart-Zyklus, die Salzburger Festspiele mit Monteverdis "L´incoronazione di Poppea" und Mozarts "Le nozze di Figaro", "Don Giovanni" und "La clemenza di Tito". Dazwischen immer wieder Zürich: Webers "Freischütz", Schuberts "Des Teufels Lustschloss" und "Alfonso und Estrella", Offenbachs "La belle Hélène", "La Périchole" und "La Grande-Duchesse de Gérolstein" oder Verdis "Aida".
In der Orchesterarbeit sind es das Concertgebouw-Orkest Amsterdam, das Chamber Orchestra of Europe, die Wiener und die Berliner Philharmoniker, mit denen Nikolaus Harnoncourt das große Repertoire zyklisch erarbeitet und immer wieder neu entdeckt hat: die Konzerte und Symphonien von Haydn und Mozart, Beethoven, Mendelssohn, Schubert, Schumann, Brahms, Dvorák und Bruckner, aber auch Béla Bartók und Alban Berg.
Ein zentraler Ort für viele dieser Projekte war die 1985 in Graz gegründete Styriarte - das steirische Festival, das Harnoncourt bis zu seinem Tod künstlerisch mitprägte.

Heute zählt Nikolaus Harnoncourt zu den wenigen wirklichen Weltstars unter den Dirigenten. Mit Auftritten wie beim Neujahrskonzert der Wiener Philharmoniker erreicht er ein Millionenpublikum - mit der gleichen Leidenschaft und dem flammenden Ernst, mit denen er überall auf der Welt konsequent vor allem eines ist: ein wahrer Diener der Kunst.

Am 5. Dezember 2015 teilte Nikolaus Harnoncourt seinem Publikum in einem offenen Brief mit, dass er sich ab sofort von der Bühne zurückziehen werde.

Am 5. März 2016 ist Nikolaus Harnoncourt friedlich in seinem Heimatort St. Georgen im Attergau im Kreis seiner Familie entschlafen.